Intérêt de la transgénèse pour comprendre les maladies à prions

Hubert LAUDE
Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires. INRA Jouy-en-Josas

Les prions, agents responsables des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles (ESST), ont des propriétés biologiques et physico-chimiques très singulières qui en font une catégorie
vraiment à part dans le règne des micro-organismes pathogènes.

Ils induisent des maladies strictement neurologiques, d’allure dégénérative et inéluctablement mortelles, qui se déclarent après une longue période d’incubation cliniquement silencieuse. Ils provoquent chez l’homme quatre maladies, dont la maladie de Creutzfeldt-Jacob (MCJ) et le Kuru, et chez les animaux, la Tremblante du mouton et l’Encéphalite spongiforme bovine (ESB), ou maladie de la vache folle. L’émergence récente de
l’ESB, dont l’agent a tué plus de 160 000 animaux au Royaume-Uni et que l’on suspecte très
fortement d’être à l’origine d’une nouvelle forme de MCJ chez l’homme, a suscité un regain de
mobilisation dans la communauté scientifique et médicale en même temps qu’un légitime émoi dans
le grand public.

Les maladies à prions : une énigme non résolue

Ces maladies évoluent en général au sein d’une espèce donnée, mais peuvent dans certains cas
franchir la barrière d’espèce, comme tout l’indique dans le cas de l’ESB. Elles obéissent à un double
déterminisme, génétique et infectieux. La nature précise de l’agent causal n’est pas complètement
élucidée. Cela rend d’autant plus malaisée le développement de méthodes de prévention ou de
traitement, qui pour l’heure font cruellement défaut.

De plus, les prions montrent une résistance exceptionnelle à des procédés de stérilisation pourtant d ûment validés vis-à-vis des autres classes de micro-organismes. Ces procédés ont de ce fait été pris en défaut lors de certaines interventions médicales ou de la production de farines de viandes destinées à l’alimentation animale.

On ne pourra répondre aux problèmes soulevés par les ESST que par la compréhension des
mécanismes intimes de la pathogénie de la maladie et de sa transmission. L’une des difficultés
auxquelles se heurtent ces recherches provient du fait qu’il n’existe pas actuellement de technique
permettant de multi-plier efficacement les prions en dehors de l’animal, comme on sait le faire pour
tant d’autres pathogènes. Des travaux en cours à l’INRA visent à développer de nouveaux systèmes
de culture cellulaire sensibles à ces agents. Pour l’heure, leur propagation en laboratoire repose
essentiellement sur l’inoculation à des rongeurs, souris ou hamster, auxquels plusieurs souches de
prions ont pu être transmises. Sans l’aide de la transgénèse, qui permet de créer à volonté des lignées
d’animaux exprimant un gène étranger ou modifié, il est clair que les connaissances sur les ESST
n’auraient pas progressé au rythme que l’on a connu durant la dernière décennie.

Sans protéine de prion, ni infection ni maladie

L’un des apports majeurs de la transgénèse a été de démontrer le rôle clé joué par une protéine de
l’hôte, désignée protéine de prion ou PrP, qui est normalement exprimée à la surface des cellules et
notamment des cellules du tissu nerveux.

Un trait marquant des ESST est l’accumulation d’une forme anormale de PrP, qui se caractérise entre autre par sa propension à former des agrégats. Certaines formes assez rares d’ESST humaines, dites familiales, sont d’ailleurs associées à diverses mutations touchant le gène spécifiant la PrP, et que l’on soupçonne de favoriser le processus de conversion en PrP anormale. La PrP anormale serait donc responsable, de façon directe ou indirecte, des désordres constatés dans le tissu nerveux des individus morts de cette maladie. Selon une théorie qui n’est pas formellement prouvée à ce jour mais qui a la faveur d’un grand nombre de scientifiques,
la PrP anormale constituerait l’agent in-fectieux lui-même. Celui-ci serait alors dépourvu de matériel
génétique, et la conversion de la protéine PrP normale en PrP anormale serait l’essence même de son
mode de propagation. Quelle que soit la véritable nature de l’agent pathogène, la PrP est indis-
pensable à sa multiplication, et cela a été prouvé de façon irréfutable par le truchement de la
lignées de souris chez lesquelles le gène spécifiant la PrP a été inactivé se montrent
intracérébrale d’une souche d’ESST, fatale chez tous les
animaux ayant un gène PrP intact. Non seulement ces souris ne font pas la maladie, mais elles se
montrent incapables de propager l’agent. Une expérience complémentaire a consisté à introduire dans
le cerveau de ces souris un greffon de tissu cérébral provenant de souris sensi-bles. Les souris ainsi
greffées restent bien portantes après inoculation intracérébrale d’une suspension infectieuse. Des
coupes de leur cerveau révèlent cependant que des lésions caractéristiques des ESST (spongiose,
accumulation de PrP anormale) sont bien présentes, mais elles sont strictement limitées au territoire
greffé. L’agent infectieux ne peut donc ni se multiplier, ni induire des lésions dégénératives dans des
cellules nerveuses qui ne synthétisent pas la protéine de prion.

Un autre type d’approche, toujours tributaire de la transgénèse, vise à identifier les domaines de la
molécule plus directement impliqués dans le processus de conversion ou indispensables à la
propagation de l’agent infectieux. A cette fin, on réintroduit chez les souris sans PrP des formes
diversement tronquées du gène. Il est également possible d’obtenir des souris chez lesquelles le gène
ne s’exprime que dans certaines catégories de cellules, afin d’examiner les effets qui en résultent sur
la réceptivité des animaux à l’infection ou sur la nature des lésions engendrées. On a ainsi pu montrer
que des animaux chez lesquels la protéine s’exprimait spécifiquement dans les astrocytes, c’est-à-dire
des cellules non neuronales, faisaient après infection une maladie très semblable à celle des animaux
normaux.

Un rôle biologique hors infection ?

L’obtention de souris sans PrP soulève par ailleurs une question intriguante : quelle est au juste la
fonction physiologique de la protéine de prion ? On s’attendrait en effet à ce que l’absence de cette
protéine, virtuellement importante dans la mesure où sa séquence est très conservée chez les
mammifères, entraîne au moins certains désordres chez les animaux, à défaut d’être létale. Or ces
animaux ont une durée de vie tout à fait normale, et ne manifestent aucun désordre locomoteur ou
comportemental apparent. Ces souris présentent cependant certaines anomalies discrètes, telles
qu’une perturbation du cycle circadien, qui suggèrent un rôle de la PrP dans la transmission nerveuse.

La transgénèse permet également de créer des animaux dont les cellules surexpriment la PrP, suite à
l’introduction de copies additionnelles du gène. Lorsque l’expression du gène excède dix fois la
normale, des désordres neuro-musculaires peuvent apparaître. Enfin, grâce à une nouvelle prouesse de
la transgénèse, les chercheurs pourront disposer à brève échéance de souris chez lesquelles
l’expression du gène sera réglable, c’est-à- dire qu’il deviendra possible d’éteindre ou d’allumer la synthèse de PrP.

De telles expériences devraient aider à élucider le rôle biologique de la PrP, ce qui n’est pas sans incidence sur la compréhension des mécanismes impliqués dans la genèse de la maladie.

La période d’incubation, face cachée de la maladie

Mais revenons à la maladie, ou plutôt à la phase qui la précède. Là encore, la transgénèse fournit des
outils irremplaçables. Tout d’abord, elle a permis d’établir qu’il existe un lien étroit entre le niveau
d’expression du gène PrP et la vitesse d’apparition des symptômes. Lorsque l’on infecte des souris
porteuses de copies supplémentaires du gène, on constate un raccourcissement substantiel de la durée
d’incubation. Au plan pratique, cela permet de créer des lignées de souris chez lesquelles la maladie
se déclenche 60 jours environ après l’inoculation viru-lente, alors que la durée d’incubation chez les
indi-vidus non transgéniques varie entre 100 et 400 jours, selon les lignées et les souches d’agent.
L’utilisation de tels modèles accélère la cadence des expériences, ce qui devrait en particulier
bénéficier à la recherche de drogues capables de freiner la multiplication de l’agent dans les tissus
nerveux, dans la perspective, pour l’instant lointaine, d’une utilisation à des fins thérapeutiques.

Le système nerveux central est l’unique siège des lésions associées aux ESST. Or la voie
intracérébrale, empruntée lors d’une inoculation expérimentale ou
accidentelle (geste neurochirurgical), n’est bien évidemment pas la voie d’accès normale de l’agent
infectieux. Le point d’entrée naturel dans l’organisme est périphérique - l’intestin par exemple, après
ingestion - et ce n’est qu’ultérieurement que l’infec-tion se développe dans le cerveau. Cette première
phase, déterminante pour l’issue de l’infection, reste très largement méconnue. L’utilisation récente
d’une série de souris transgéniques avec un gène PrP normal, mais déficientes en une catégorie
donnée de cellules immunitaires, a ouvert une voie qui semble également très prometteuse. En effet,
les souris pro-venant d’une lignée déficiente en lymphocytes B, et qui sont par ailleurs normalement
sensibles à une infection par voie intracérébrale, ne font pas de mala-die lorsque l’agent est inoculé
par voie périphérique. Autrement dit, l’infection est stoppée avant la phase de neuroinvasion. Ce
résultat indique qu’au moins une population de lymphocytes B est impliquée dans la phase précoce de
l’infection. Ces cellules pour-raient entre autre représenter le site initial de multi-plication de l’agent.

La barrière d’espèce

Un autre volet des recherches sur les ESST faisant largement appel à la transgénèse concerne la
barrière d’espèce, un aspect particulièrement important puisqu’il touche au problème de la
transmission interspécifique. La notion de barrière d’espèce se réfère à la capacité limitée qu’ont les
agents d’ESST à induire la maladie chez un animal d’une autre espèce : lors des premiers passages
dans une espèce différente, la période d’incubation est beaucoup augmentée et le nombre d’animaux
malades est en général très inférieur à ce qu’il est dans l’espèce d’origine. La transgénèse a permis de
démontrer que la protéine de prion était un déterminant majeur de cette barrière d’espèce. L’une des
expériences les plus démonstratives a consisté à infecter des souris exprimant un transgène PrP de
hamster avec une souche d’agent propagée sur hamster, à laquelle la souris est normalement
réfractaire : la totalité des animaux se sont infectés et ont développé la maladie dans un délai
comparable à celui observé chez le hamster. Ce délai peut encore être raccourci si le gène de hamster
est introduit chez des souris sans PrP endogène. Par conséquent, la substitution du gène PrP de souris
par celui du hamster fait que la souris transgénique se comporte comme un hamster vis-à-vis de
l’agent infectieux !

L’application évidente d’une telle observation est la création de souris offrant une sensibilité accrue à
l’infection par des souches d’agent responsables d’ESST chez l’homme ou les animaux domestiques.
On a récemment obtenu des souris exprimant un transgène PrP bovin, et qui sont infectables par
l’agent de l’ESB avec une efficacité de 100 % et un délai d’incubation de 150 jours. L’INRA poursuit
des travaux similaires dans le but d’obtenir des souris plus réceptives à l’agent de la Tremblante
ovine. La barrière d’espèce reflète l’existence d’un certain degré de divergence, plus ou moins élevé,
des séquences de PrP entre différentes espèces. Il n’est toutefois pas possible d’évaluer la probabilité
d’un passage trans-spécifique sur la base du taux de divergence. A titre d’illustration, le taux de
divergence bovin/homme, proche de 12 %, ne semble pas empêcher le passage à l’homme, alors
qu’avec un taux deux fois plus faible le passage hamster/souris est pratiquement impossible. Cela
signifie que certains domaines de la protéine PrP seraient plus déterminants que d’autres dans ce
phénomène de barrière. L’utilisation de transgènes correspondant à des chimères inter-spécifiques,
par exemple homme/souris, devrait permettre, là encore, de mieux cerner quels sont ces domaines.
Enfin, il faut savoir que la substitution de gène n’est pas toujours suffisante pour abolir la barrière
d’espèce, ce qui suggère l’intervention d’autres facteurs que la transgénèse permettra peut-être aussi
de découvrir.

Conclusions

La mise en oeuvre et le perfectionnement des techniques de transgénèse chez la souris a été et
continue d’être un atout capital pour l’avancement des recherches sur les ESST.

Au travers de schémas expérimentaux variés, cette technologie a permis d’acquérir des connaissances tout à fait essentielles sur la biologie, la pathogénie et la génétique des ESST.

Celles-ci mettent en lumière le rôle primordial de la protéine PrP dans la propagation de l’agent infectieux, l’apparition des lésions neurodégénératives, et la barrière d’espèce. Il est pratiquement certain que dans les années à venir cette technologie pourra être étendue, sous certaines réserves, à des grands mammifères : à quand le premier mouton porteur d’un gène de PrP inactivé ?

Bibliographie

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